告别黑白条带，迎接五彩斑斓

告别黑白条带，迎接五彩斑斓

        谈起免疫印迹（Western Blot）检测，做科学研究的大家都知道，做蛋白机制研究都离不开WB检测，在过去我们的WB结果都是白底黑带，但是近年经常阅读SCI文献，发现很多高分影响因子文献的WB结果图发生很大的变化：白底变成了黑底，条带从黑色变成了：红，橙，黄，绿，蓝等各种颜色，条带亮度，对比度都很明显，不同蛋白还能呈现出不同颜色的条带，提高文章质量，体现出文章高级感。

       一、荧光WB的优势

       化学发光信号是动态的，二抗是酶标记，属于酶促动力学反应，信号随时间的变化而变化，信号不与目标蛋白浓度成线性比例关系。而荧光信号荧光是静态信号，不会随着时间的变化而变化，信号持久，可达到精准定量。

       二、实验操作步骤

      常见Western Blot显色的方法主要有：放射自显影、底物化学发光ECL、底物DAB呈色，荧光WB实验步骤与传统WB差异不是很大，最主要区别在于二抗：传统WB检测二抗是酶标记（HRP），而荧光WB二抗是用荧光标记，现在省掉繁杂的显影，暗室等步骤，取而代之是利用荧光成像仪直接成像。

      1、传统WB: 样品制备→SDS-PADE电泳→蛋白转膜→ 一抗孵育→HRP酶标二抗→化学发光

      2、荧光WB: 样品制备→SDS-PADE电泳→蛋白转膜→一抗孵育→荧光二抗→荧光成像

         三、实验结果

传统WB与荧光WB比较

       四、实验注意事项

        1、实验中孵育荧光二抗时要注意避光，荧光二抗多次重复使用，避免荧光背景。

        2、由于少量的激发光会穿过滤光片，因此曝光时间更长会导致背景荧光较高，需要注意避光。

        3、荧光二抗和荧光WB更配，适合做荧光WB的二抗有：

        山羊抗小鼠IgG二抗， 近红外DyLight 680荧光标记

        山羊抗小鼠IgG二抗， 远红外DyLight 800荧光标记

        山羊抗小鼠IgG二抗， 绿色DyLight 488荧光标记

        山羊抗小鼠IgG二抗， 橙红色DyLight 594荧光标记