细胞免疫荧光

细胞免疫荧光

一、简介

       免疫荧光染色(Immunofiuorescence,IF)的主要原理利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括直接法和间接法。直接法是蛋白和标记荧光素一抗结合，间接法

是蛋白和一抗结合，然后再与带有荧光基团的二抗识别，荧光显微镜下即可观察到荧光。

二、试剂与材料

1、生长于盖玻片的贴壁细胞

2、封闭液（5%BSA/PBS）、抗体稀释液（1%BSA/PBS）

3、固定剂

(1）冰甲醇和冰丙酮-20℃放置1h以上

(2）3%-4%多聚甲醛/PBS和0.5%Triton X-100/PBS

(3）3%-4%多聚甲醛/PBS和冰丙酮-20℃放置1h以上

4、一抗、荧光素标记二抗

5、封片介质、湿盒、组化笔、荧光显微镜

三、操作步骤 (间接法)

1、细胞制备:从细胞培养箱取出细胞爬片，光学显微镜下观察细胞生长成单层，弃上清液，PBS洗1次。

2、细胞固定：根据抗原和组织细胞特点选择以下一种细胞固定方法。

a. 甲醇/丙酮固定法：冰甲醇-20℃固定10min,弃多余甲醇，冰丙酮-20℃透化细胞1min。

b. 多聚甲醛/Triton固定法:3%-4%多聚甲醛/PBS固定10 min，PBS冲洗，0.5%Triton X-100透化细胞2-10 min。

c.多聚甲醛/甲醇固定法:3%-4%多聚甲醛/PBS固定10 min，PBS冲洗，冰甲醇-20℃透化细胞5-10 min。

3、洗涤：PBS浸洗3次，每次5 min。去除多余的PBS。

4、封闭：5%BSA/PBS室温封闭30 min。

5、一抗孵育：滴加适当的一抗浓度在湿盒中室温孵育1h或者4℃过夜。PBS浸洗3次，每次5min。

6、二抗孵育：加适当稀释的荧光素标记二抗，使其覆盖细胞，置于黑色湿盒内室温孵育30min 以上。PBS浸洗3次，每次5min。

7、封片：滴加抗荧光衰减封片剂封片

8、荧光显微镜观察。

四、结果展示

五、实验注意事项

1、固定剂种类很多，大致分为有机溶剂和醛类交联固定剂2类。①有机溶剂如甲醇和丙酮细胞穿透性强，能够溶解如细胞膜磷脂(细胞透化)等类脂成分和脱水，使蛋白质和糖类抗原

转变为不溶性沉淀，适合蛋白质和糖类抗原的固定。冷丙酮组织细胞穿透性和脱水作用强，抗原保存性好，常用于冷冻切片和细胞固定。②醛类交联固定剂穿透性强，交联细胞内自

由氨基团，使组织蛋白质相互交联，抗原保持原位，在保持组织细胞结构完整性方面优于有机溶剂。贴壁和悬浮细胞表面抗原检测时可以采用4%多聚甲醛固定，胞内抗检测时加通

透剂如Triton X- 100。

2、如需检测2种抗原时，可进行双重荧光染色。间接法时，应确保二抗靶向不同种属抗原特异性抗Fc, 并偶联至不同染料。

3、防止荧光淬灭。

六、问题和解决方法