Hoechst 33258染色

Hoechst 33258染色

一、简介

       Hoechst 33258，也称bisBenzimide H 33258或HOE 33258。分子式为C25H24N6O · 3HCl，分子量为533.88，索莱宝，C0021

       Hoechst 33258是一种可以穿透细胞膜的蓝色荧光染料，对细胞的毒性较低。Hoechst 33258 为特异性 DNA 染料，与 A-T 键结合，这种染料对死细胞或经 70% 冷乙醇固定

的细胞可立即染色。而活细胞的着色是渐进性的，在 10min 内可达饱和。在荧光显微镜下，活细胞核呈弥散均匀荧光，出现细胞凋亡时，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块

状荧光。

       Hoechst 33258的最大激发波长为346nm，最大发射波长为460nm；Hoechst 33258和双链DNA结合后，最大激发波长为352nm，最大发射波长为461nm。

二、试剂与材料

       1. Hoechst 33258 即用型染液浓度为1mg/mL，使用前用生理盐水或PBS将Hoechst 33258染液稀释100倍，即为工作液。

       2. 封片液：抗荧光衰减封片剂

       3. 细胞固定液： 甲醇、冰乙醇（ 3∶1 ）现配； 70%冷乙醇；4%多聚甲醛。

三、操作步骤

       1、细胞制备:从细胞培养箱取出细胞爬片，光学显微镜下观察细胞生长成单层，弃上清液，PBS洗1次。（若荧光显微镜是倒置就不需要细胞爬片）

       2、细胞固定：细胞给药发生凋亡后，去除培养液，加入0.5ml固定液（注：4%多聚甲醛），固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

       3、洗涤：PBS浸洗3次，每次5 min。去除多余的PBS。

       4、染色：加入0.5 ml Hoechst 33258染色液(5mg/L)，染色5 min。可用摇床，或手动晃动数次。PBS浸洗3次，每次5 min。

       5、封片：滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡。使细胞接触封片液，切勿弄反。

       6、荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长在350nm左右，发射波长在460 nm左右。

       注：室温下晾干,在荧光(检测波长360nm,参比波长450nm ) 显微镜下观察, 并随机拍照。

四、结果展示

五、实验注意事项

       1、如果荧光显微镜是倒置的，就不用爬片，可以直接固定，染色，观察。不是倒置的无法直接看，爬片后，倒盖在玻片上，显微镜才可以看。

       2、该染料不建议活细胞染色，活细胞染色细胞很容易漂浮起来，不宜观察和荧光拍照，染料浓度过大导致细胞死亡，正式实验前要摸索浓度和孵育时间。

       3、防止荧光淬灭。

       4、普通洁净盖玻片置于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片置于六孔

板内，加细胞混悬液培养过夜，使约为50%-80%满。