聊聊细胞支原体污染

        一、简介

       支原体是一种大小介于细菌和病毒之间(最小直径0. 2μm) 并独立生活的微生物，约有1%可通过滤菌器。支原体无细胞壁形态呈高度多形性，可为圆形、丝状或梨形。支原体形态多变，在光境下不易看清内部结构，电镜下观察支原体膜为三层结构。其中央有电干密度大的密集颗粒群或丝状的中心束。支原体多吸附或散在于细胞表面和细胞之间。

      二、支原体的污染来源

       1、细胞之间交叉污染

       2、细胞培养操作人员的口腔、皮肤等

       3、工作环境或实验器材的污染

       4、培养基的污染

       三、支原体污染的严重性

       1、细胞外形可以没有明显的变化，支原体可以与细胞共存，污染后细胞液不会死亡，培养基一般不发生浑浊。

       2、使用被支原体污染的细胞做实验会严重影响实验的结果，因为支原体会抑制细胞生长；导致染色体畸变；细胞膜抗原性改变；细胞复苏后存活率降低等。

       3、影响细胞的代谢和功能：培液中的精氨酸被支原体大量消耗，引起细胞蛋白质、DNA、rRNA、mRNA的合成障碍；支原体活动使培液成分发生改变（如发酵型支原体降解糖类产生酸性物质），影响细胞代谢。

       4、培养过程细胞破碎多，培养基pH变化明显，需要频繁更换新鲜培养基。

       5、细胞被支原体污染后会形成共生体系导致污染不断扩大。

       四、支原体检查法（常用检查法）

      1、指示细胞培养法

       DNA染色法：供试品接种于指示细胞（无污染的Vero细胞或经国家药品检定机构认可的其他细胞）

      2、支原体荧光定量PCR检测试剂盒(qPCR一步法）

       FAM通道：检测支原体荧光信号。HEX通道：检测内控对照荧光信号。

       支原体DNA和内控DNA存在信号的竞争性抑制。

       支原体DNA越多，FAM通道信号越高，检测内控对照的HEX通道信号越低。

       定量需基于Ct值和DNA标准曲线。

       Ct＜40为阳性结果。Ct≥40为阴性结果。

       3、PCR法支原体检测电泳

       +：阳性对照； - ：阴性对照；1：送检样品（感染支原体）；2：送检样品（未感染支原体）；3：样品1的干扰实验；4：样品2的干扰实验。

       若在270bp处有条带，检测结果为阳性。阳性对照及干扰实验PCR产物在270bp处有一条带，阴性对照无条带，证明本次实验准确可靠。

       4、试剂法（诺唯赞支原体检测试剂，D101-01）

       加样

       样品：向反应管中加入1 μl待测培养液上清

       MycoBlue Buffer   24 μl

       MycoBlue Enzyme   1μl

       阳性对照：加入1 μl Positive Control

       阴性对照：不加入任何样品或加入1 μl Nuclease-free ddH2O

       ▲如果反应是在水浴锅中进行，则在每管中加入25 μl Paraffin Oil。

       ▲如果反应是在PCR仪中进行，不需要加入Paraffin Oil。

       反应将水浴锅或PCR仪温度设置成60℃，放入反应管，孵育60 min。

       结果：有阳性结果说明细胞有支原体污染，支原体污染严重细胞形态变性有拉丝的现象。