新到细胞如何处理

新到细胞如何处理

      一、先梳理细胞的基本信息如下：

                                                         细胞正常图片

       二、贴壁细胞处理操作步骤

       1、检查细胞外包装是否有无漏液，在显微镜100倍和200倍观察拍照保存图片。

       2、做好消毒工作后，将细胞转移到培养箱中平衡2-6 h。

       3、转移消毒超净台，将培养瓶立起收集培养基。

       4、胰酶消化（含 EDTA 0.25％）细胞，待细胞变圆后终止消化，转移至 15 mL 离心管中1000 rpm，5min 离心弃掉上清。

       5、使用收集的完全培养基培养重悬细胞，进行更换带透气孔培养瓶，细胞生长稳定后换实验室准备好的培养基。

      三、细胞传代操作步骤

       1、提前超净台灭菌照射 30 min 左右。

       2、显微镜观察细胞密度约 80%即可传代。

       3、弃去培养基，加入 PBS清洗 2-3 遍即可。

       4、加适量胰酶消化（含 EDTA 0.25％），待细胞变圆后终止消化。

       5、转移至 15 mL 离心管中1000 rpm，5 min 离心弃掉上清。

       6、加入完全培养基重悬，置于细胞培养箱中培养。

       四、细胞复苏操作步骤

       1、准备工作：将完全培养液置37℃水浴锅预热30 min。

       2、将细胞从干冰里取出，检查冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂。用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子，防止细菌污染），使其在 1 min左右完全融化。

       3、将细胞悬液转至提前准备好的完全培养液中，离心1000 rpm 室温 5 min 。

       4、弃上清，吸取1 mL完全培养液重悬细胞至单细胞悬液，转移至装有4 mL完全培养液的T25 cm2培养瓶 中，标记细胞名称、复苏日期、 代次，放置 37℃、5% CO2培养箱中培养。

       5、第二天观察细胞状态及贴壁情况。

       五、细胞冻存操作步骤

       1、超净台灭菌照射 30 min 左右。

       2、显微镜观察细胞密度约 80%可传代。

       3、弃去培养基，加入 PBS清洗 2-3 遍即可。

       4、加适量胰酶消化（含 EDTA 0.25％），待细胞变圆后终止消化。

       5、转移至 15 mL 离心管中1000 rpm，5 min 离心弃掉上清。

       6、细胞冻存液配置：胎牛血清与 DMSO =9:1 的比例配置冻存液1 mL 即可。加入 1 mL冻存液重悬转移入冻存管，标记细胞名称、细胞代数和日期。

       7、将冻存管放入程序降温盒，-80℃冰箱过夜，次日移入液氮罐中长期保存。

       六、注意事项

       1、复苏操作时间不可太长，尽量在15min内完成。请勿直接复苏到T75cm2瓶或10cm皿，面积太大影响的生长速度，建议复苏在T25瓶。

       2、若复苏后24h细胞状态不好或分化较多，建议再次复苏时根据细胞量复苏到六孔板里。

       3、多种细胞系进行维持传代操作时，各细胞系所需的器材和溶液没有严格分开,往往会使一种细胞被另种细胞污染。

       4、血清质量差异可能会对细胞生长有影响，建议使用高级血清进行培养，如果没有高级血清，可提高血清浓度进行培养。

       5、每一种细胞系都应有充足的冻存储备，防止细胞污染等因素造成细胞系绝种，而且每一批次培养的细胞状态都不同，应该选状态较好批次冻存保种。另外二倍体细胞等有限细胞系如果暂时不用最好冻存以免传代太多，造成细胞衰老或者发生改变。