免疫组化操作步骤IHC 试验操作步骤
实验所需试剂：
3% H2O2 For 10.0 ml
1.0ml H2O2 (30%)
9.0ml 单蒸水
TBS(1×) pH 7.6-8.0 For 1.0 L 3.0g Tris-base 8.0g NaCl 先加单蒸水至800ml，用HCL 调PH 至7.6-8.0加单蒸水至1.0L
TBST(1×) 0.1% Tween-20pH 7.6-8.0
柠檬酸-柠檬酸钠修复液（1×）pH6.0 For 1.0 L 0.4g 柠檬酸· H2O
3.0g 柠檬酸钠 · 2H2O
加单蒸水至1.0 L
实验步骤：
一. 脱蜡： 在二甲苯（Ⅰ）中 20min，在二甲苯（Ⅱ）中 20min; 在无水乙醇（Ⅰ）中浸泡5min; 在无水乙醇（Ⅱ）中浸泡 5min; 95%乙醇中浸泡5min; 80%乙醇中浸泡5min; 60%乙醇中浸泡 5min; 单蒸水中 5min 泡洗三次。
二. 抗原修复： 取一定量的Tris-EDTA修复液于一带盖耐高温容器里，再将容器于电陶炉上煮沸，后再放入待修复切片持续沸腾15min。完毕，放在室温自然冷却，40min后，降至室温。 备注：根据不同实验条件可选择柠檬酸修复液等不同修复液。对于某些切片必须进行修复，某些切片如果容易脱片可以省略。
三. 免疫组织化学染色：
（1）取出切片架放入3%H2O2 溶液，于孵育盒中灭活10min，室温;
（2）1xTBS 冲洗4-5 次，甩干，擦净，滴加3％BSA50ul-100ul，室温湿盒封闭1hour；
（3）用吸水纸吸去多余液体（注意不要干片），滴加稀释好的一抗50 ul-
100ul，室温湿盒孵育 1.5hour 或 4℃过夜;（4）1xTBST 冲洗4-5 次，滴加二抗50-100ul，室温湿盒孵育30min;
（5）1xTBS 冲洗4-5 次;滴加DAB 显色液，1－5min 后迅速冲洗干净;
（6）滴加1 滴Mayor's 苏木精（hematoxylin），复染1-2min,TBS 溶液或自来水中水洗蓝化5-10min；
（7）梯度酒精及二甲苯脱水：分别在60%,80%,95%,100%Ⅰ、Ⅱ酒精中浸泡 5
分钟，然后在二甲苯（III）中浸泡5 分钟，二甲苯（IV）中浸泡5 分钟。中性树
胶封片，镜检。 |
