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蛋白免疫印迹(WB)

价格
120.00
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编号 0022
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♦ 服务介绍


       蛋白质免疫印迹法 (Western Blot ) ,简称WB ,是指通过SDS-PAGE胶将不同分子量的蛋白质分离开,然后将目标蛋白转移到载体(PVDF)膜上,利用抗原抗体的特异性结合,用特异性的一抗结合目标蛋白,用HRP标记的二抗结合一抗,再加以ECL发光液显色,检测组织或者细胞内某种或者某些特异性蛋白质的表达。蛋白质免疫印迹是做蛋白质分析的一种常规技术,常用于鉴定某种蛋白,并能对蛋白进行定性和半定量分析,还可以用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。


实验流程


       蛋白提取-制胶-电泳-转膜-封闭-一抗孵育-二抗孵育-化学发光-结果分析;


实验样品要求


       (1)细胞不少于5×106个,收集细胞沉淀,干冰运输。

       (2)组织样品不少于50mg;

       (3)总蛋白浓度不低于 2μg/μl(至少50μl);


注意事项


       (1)每张膜上做一种目的蛋白和相应的内参蛋白。每张膜上可以做8个样品。一般状况下,2周即可完成实验。如遇特殊情况,如一抗不好,蛋白浓度低或蛋白特殊,如分子量大等,周期会有所延长。

       (2)Western Blot细胞蛋白样本的准备及运输:去掉培养液,用PBS洗一次后,加入少量PBS,用细胞刮将细胞刮下,用1ml枪吸取细胞易于1.5ml EP管中,快速离心(升至最高转速就可stop)去除上清后,可按下面两种方法运输:A.细胞干运输:将细胞干放入液氮速冻,-80℃保存; 如需长途过夜运输,建议干冰运输;如当天送达样本,可用液氮或者-80℃冰袋运输;B.细胞裂解液运输:加入一定量的胞裂解液后即可冷藏运输(冰袋或者冰盒)。如需检测磷酸化蛋白,建议裂解液中加入终浓度1mM的NaF,NaF可抑制磷酸酶活性,保护蛋白磷酸化水平。如果加入裂解液后提取蛋白,则置于冰上裂解1 h,12000rpm离心10 min后取上清,即为蛋白样本。蛋白样本可-20度冷藏运输(建议快递寄送用干冰或者足量-80度冰袋),保存需要-80℃。

       (3)蛋白样本运输:蛋白样本需要经过浓度测定,再进行变性,变性时先加入Sample buffer,再95℃ 10 min,Sample buffer可防止变性导致的蛋白沉淀析出。变性的蛋白可直接冷藏运输,-20℃稳定保存。

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